Lablog1-176：rNP-A及びrNP-Bの生産と精製、Image-Jを用いた定量

Date 2024-03-19

Details of results

<実験操作>

1. 大腸菌C43(DE3)を用いたrNP-A及びrNP-B生産
2. Ni-NTAオープンカラムを用いた精製(Base buffer: 50 mM HEPES)
3. SDS-PAGEとImage-Jを用いた定量

<実験結果>
1 rNP-A及びrNP-Bの生産
　rNP-A及びrNP-Bを大腸菌C43(DE3)を用いて生産し、超音波破砕により調製した菌体内可溶性画分(100 mL culture)からNi-NTAオープンカラムを用いてタンパク質を精製した。Fig. 1にSDS-PAGE及びWestern Blotting により発現確認を行った結果を示す。Elution 1のSDS-PAGEの結果より60 kDa付近に単一バンドが確認できることから菌体内可溶性画分中からrNP-A及びrNP-Bを高純度に回収することが可能であると示された。同様にWestern Blottingにおいても60 kDa付近にバンドが確認されたことから、Ni-NTAカラムを用いて10×His tagを有するrNP-A及びrNP-Bが精製できていることが明らかとなった。
2 Image-Jを用いたrNP-A及びrNP-Bの定量
　続いて、Image-Jを用いて精製後のrNP-A及びrNP-Bを定量した。50 mM HEPES-500 mM NaCl-200 mM Imidazoleを用いて調製した1000-93.8 μg/mL BSA及び精製後のrNP-A及びrNP-B(n=2)のSDS-PAGEの結果をFig. 2に、SDS-PAGEのバンドの平均輝度をImage-Jにより定量した結果をTable 3に示す。濃度既知のBSAを用いて検量線を作成し、rNP-A及びrNP-Bの濃度を算出した。それぞれの精製後の濃度はrNP-Aが259.0 μg/mL、rNP-Bが524.6 μg/mLであり、その生産濃度はrNP-Aが2.6 mg/L、rNP-Bが5.2 mg/Lであった。

File